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背景資料

     Exosomes,中文名外泌體，因其形態(tài)而得名，直徑為30-150nm，是細胞外泌囊泡中體積較小的一種。是一種能被大多數(shù)細胞分泌的微小膜泡，具有脂質雙層膜結構。盡管外泌體最初在1983年就被發(fā)現(xiàn)，但人們一直認為它只是一種細胞的廢棄物。然而最近幾年，人們發(fā)現(xiàn)這種微小膜泡中含有細胞特異的蛋白、脂質和核酸，能作為信號分子傳遞給其他細胞從而改變其他細胞的功能。

    研究發(fā)現(xiàn)外泌體在很多生理病理上起著重要的作用，如免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等。不同細胞分泌的外泌體具有不同的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。此外外泌體具有脂質雙層膜結構，能很好的保護其包被的物質，且能靶向特定細胞或組織，因此是一種很好靶向給藥系統(tǒng)（targeteddelivery system）。

Meilunbio外泌體提取試劑盒

Meilunbio exosome isolation kit

（for Cell Culture Media）

產品貨號：MA0402  50ML [￥2800.00]

http://m.thebestconsultoria.com/goods.php?id=22932

簡介

外泌體是包含了復雜RNA和蛋白質的小膜泡(30-150納米)，由不同類型的細胞在培養(yǎng)過程中分泌，在體液(包括血液、唾液、尿液和母乳)中大量存在。外泌體被認為是細胞間的信使，在特定的細胞之間傳遞效應物或信號分子。然而，外泌體的形成和組成以及它們所涉及的生物學途徑仍不完全清楚。

外泌體功能和轉運等生物學研究需要分離完整的外泌體，美侖外泌體提取試劑盒（細胞培養(yǎng)基上清）（Meilunbioexosomeisolation kit (for Cell Culture Media)）是專門用于分離提取細胞培養(yǎng)基上清樣本中外泌體的試劑。本產品提供了一種簡單可靠的方法從細胞培養(yǎng)基上清樣本中濃縮完整的外泌體：通過捆綁水分子，迫使較難溶解的組分(即外泌體)離開溶液，經(jīng)過簡單的較低速度離心即可從樣本中分離出大量外泌體。本產品與傳統(tǒng)的超高速離心相比，樣本中的外泌體所受到的壓力較小，可以保持較完整的形態(tài)；同時提取過程所需要的時間更短、所需要的樣本起始量更低、提取效率更高。使用本產品獲得的外泌體可適用于多種下游實驗，如RNA分析、高通量測序、細胞共培養(yǎng)等。

本試劑盒足夠分離提取100mL細胞培養(yǎng)基上清中的外泌體。

圖1.Hela細胞培養(yǎng)基上清外泌體NTA測試與進口品牌對比。(A)粒徑分布圖；(B)外泌體樣本電影圖片。以上數(shù)據(jù)顯示美侖與進口品牌提取的外泌體NTA結果非常接近。儀器型號: ZetaView PMX 110 (Particle Metrix, Meerbusch,Germany)。

圖2. Hela細胞培養(yǎng)基上清外泌體RNA和蛋白檢測與進口品牌對比。(A)外泌體總RNA濃度鑒定；(B)外泌體總蛋白CD63western blot 檢測（anti-CD63一抗購自abcam(ab134045）。以上數(shù)據(jù)提示美侖外泌體提取總量要高于進口品牌。

詳情

樣本準備：

1. 收集細胞培養(yǎng)基。

2. 將細胞培養(yǎng)基以3000×g離心20分鐘，去除細胞和碎片。

3. 小心將步驟2得到的細胞培養(yǎng)基上清液轉移到新的試管中。

外泌體分離：

1. 將所需體積的無細胞培養(yǎng)基轉移到新試管中，并添加0.5體積的外泌體提取試劑。（可以參考下表）

2. 將培養(yǎng)基和外泌體提取試劑混合物進行渦旋或上下顛倒混合，直到得到均勻的溶液。

3. 4℃孵育過夜。

4. 孵育后，于2 ~ 8℃，10000×g離心1小時。

5. 吸出并丟棄上清液，外泌體則包含在管底的沉淀中(有些時候肉眼較難分辨)。

6. 使用1X PBS或適當緩沖液重懸外泌體，參考下表。

7. 外泌體沉淀被重懸以后就可以通過親和法進行下游分析或進一步純化。

8. 將分離得到的外泌體保存在2℃至8℃，最長保存1周，或≤-20℃長期保存。

注意事項：

1. 本品適用于各種類型細胞培養(yǎng)液上清中外泌體的提取。為防止FBS中較多的牛外泌體造成污染，可在細胞培養(yǎng)至50%-70%左右更換無血清培養(yǎng)基或者不含外泌體的血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)約12~48h后收集上清使用。也可直接使用不含外泌體的血清培養(yǎng)基直接培養(yǎng)細胞，后續(xù)直接收集細胞培養(yǎng)液上清進行外泌體提取。

2. 一次實驗需要多少體積細胞培養(yǎng)液取決于上清中外泌體的量，可能受細胞類型、狀態(tài)、數(shù)目的影響各不相同，根據(jù)實驗需求決定樣本起始量。

3. 用固定角度的離心機離心時，需標記管子的擺放方向。一般樣本中外泌體含量較少，離心后可能肉眼觀察不到沉淀，標記方向后，在重懸時將1×PBS朝離心管靠外側的內壁反復吹打洗脫即可。

4. 離心后的沉淀可用100-200 μL的1×PBS重懸后使用，也可使用下一步實驗的試劑直接處理沉淀。例如，可直接使用裂解液吹打重懸沉淀后進入RNA、蛋白質提取流程。 

保存條件：

4oC保存，一年有效。

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關于外泌體應用領域小貼士

1腫瘤早期發(fā)現(xiàn)體外診斷，精準醫(yī)療

液態(tài)活檢已經(jīng)被評為2015年度十大突破性技術之一，并且在2015年12月的《NSCLC血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》中規(guī)范了中國EGFR的血液檢測，以期能夠推動肺癌的精準治療，這無疑顯示出了這項技術的巨大進步以及在臨床應用中的巨大潛力。

液態(tài)活檢按照檢測的對象分類，可以分為核酸水平的ctDNA檢測和細胞水平的循環(huán)腫瘤細胞（CTC）檢測以及外泌體（Exosome）檢測。隨著液態(tài)活檢技術的廣泛應用，人們已經(jīng)對CTC和ctDNA有了較為深入的了解，也開發(fā)出很多基于CTC和ctDNA檢測技術的平臺，但是對作為液態(tài)活檢“三駕馬車”之一的外泌體（Exosome）卻研究的很少，一直以來科學界對其均沒有給予足夠的重視，所以關于其作用機制的研究也不夠深入和透徹。不過隨著美國科學家詹姆斯·羅斯曼、蘭迪·謝克曼和德國科學家托馬斯·蘇德霍夫因為在發(fā)現(xiàn)細胞囊泡運輸系統(tǒng)及其運行調節(jié)機制研究中的杰出貢獻而榮獲諾貝爾醫(yī)學獎，這種外泌體（Exosome）被忽視的情況正在發(fā)生改變，很多研究機構和課題小組開始重視對外泌體（Exosome）的研究，相關文獻不斷被報道出來，增進了人們對外泌體（Exosome）的認知。

外泌體（Exosome）一詞最早出現(xiàn)在1981年，但是直到2007年發(fā)現(xiàn)外泌體（Exosome）可以作為細胞間基因交流的機制時，才重新激發(fā)了人們對外泌體（Exosome）研究的興趣。隨著科學研究的不斷深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)外泌體（Exosome）是由通過細胞內吞泡膜向內凹陷形成多泡內涵體，多泡內涵體再與細胞膜融合后，釋放到細胞外基質中的一種直徑約30~120nm的膜性囊泡。外泌體（Exosome）內含物的很大部分是蛋白質，如：CD9、CD63、CD81、MHC-I等；腫瘤細胞產生的外泌體（Exosome）中還可以檢測到過度表達的特異性的蛋白標志物，如TRAIL和TGF-β等。除已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛋白質外，外泌體（Exosome）中還含有大量的mRNA、miRNA、cirRNA和DNA片段等成分，由于這些內容物的存在提供了豐富的生物信息，可以多方位、多角度的揭示出疾病信息，這就蘊藏了巨大潛力。而且，外泌體（Exosome）來源廣泛，淋巴細胞、樹突狀細胞、肥大細胞及上皮細胞、腫瘤細胞等都可以分泌外泌體，被分泌出的外泌體（Exosome）還會進入羊水，腹水，唾液，血液，乳汁，尿液中，這就極大地拓展了檢測途徑，使臨床檢測變?yōu)榭赡堋?/span>

外泌體（Exosome）最初被認為是毫無作用的“垃圾”，但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)事實并非如此，外泌體（Exosome）是具有功能活性并可進行細胞間信息傳遞的微囊泡，其可以介入機體免疫、新陳代謝以及腫瘤生長和產生耐藥性各個方面。

目前國內在液態(tài)活檢領域主要集中在CTC和ctDNA，外泌體（Exosome）還鮮有涉及，而美國企業(yè)具有一定的技術優(yōu)勢，目前已經(jīng)開發(fā)的可用于外泌體分析的技術有：超速離心法（最常用的外泌體純化手段，采用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒）、密度梯度離心法（通過密度梯度離心，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集）、超濾離心（利用不同截留相對分子質量的超濾膜對樣品進行選擇性分離，便可獲得外泌體）、磁珠免疫法（外泌體表面有其特異性標記物，用包被相應抗體的磁珠與外泌體共同孵育后，即可將外泌體吸附并分離出來）、PEG-base沉淀法（聚乙二醇可與疏水性分子結合共沉淀，被用來沉淀外泌體）、新一代測序分析（從癌癥患者的體液中分離出外泌體，對其中的DNA、RNA進行全基因組、外顯子組和轉錄組測序分析，篩查腫瘤細胞來源的基因突變情況）。

腫瘤在生長過程中會不斷地將外泌體（Exosome）釋放到周圍環(huán)境中去，同時，外泌體（Exosome）能在4℃保存96h，或是在-70℃下保存更長時間，可以從患者的體液中分離外泌體（Exosome）用于早期臨床診斷。隨著技術的進步，已經(jīng)有生物公司嘗試涉足外泌體領域，如Codiak BioSciences公司（檢測胰腺癌癌細胞外泌體中所包含的一種蛋白Glypican-1，這種蛋白有可能作為一種非侵入性診斷和篩查處于適合手術治療階段的早期胰腺癌）；Exosome Diagnostics公司推出全球首個基于外泌體（Exosome）RNA的液態(tài)活檢產品：ExoDx Lung（ALK）（是一種基于血漿外泌體（Exosome）的診斷產品，可準確檢測非小細胞肺癌患者的EML4-ALK突變）。還有外泌體（Exosome）中存在黑色素瘤標志物包括MIA、S100B和酪氨酸酶相關蛋白2，且黑色素瘤患者胞外體中MIA和S100B濃度顯著高于健康人群和非黑色素瘤患者，通過檢測MIA和S100B表達水平對黑色素瘤的診治具有積極地參照作用。

所有真核細胞類型包括造血細胞、上皮細胞、神經(jīng)細胞、干細胞、脂肪細胞和癌癥細胞均可在培養(yǎng)條件下分泌外泌體。體內所有體液，包括血液、唾液、腦脊液、腹水，甚至尿液中都可以分離得到外泌體。這些外泌體傳輸多種信號分子，包括蛋白質、信使核糖核酸（mRNA）和非編碼核糖核酸（RNA），其攜帶的分子可以被其他細胞吸收。因此，外泌體可以將生物信息轉移到相鄰細胞。這種細胞間通信不僅涉及生理功能，還涉及一些疾病的發(fā)病機理，包括腫瘤、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等。

目前，在各種健康與疾病模型中都發(fā)現(xiàn)，外泌體通過分子信息傳遞扮演著重要的角色。外泌體還越來越多地被認為是疾病的生物標志物和預后因子，具有重要的臨床診斷和治療意義。除此之外，它們還有潛力被用于臨床，作為基因和藥物遞送的載體。

疾病早期診斷和預后。健康人和多種疾病的患者會將含有不同RNA和蛋白質成分的外泌體釋放到體液循環(huán)中，因其特殊性，外泌體可以作為生物標志物來對疾病進行檢測。例如，從血液或尿液中分離的外泌體可以用作癌癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心臟病的診斷和預后的指標。

目前，腫瘤的早期診斷受限于發(fā)現(xiàn)時間太晚以及診斷過程的煩瑣、費用昂貴。因此，在人體體液內尋找和檢測腫瘤細胞分泌的外泌體可能會是一種新穎的、無創(chuàng)的、高度可靠的診斷方式。例如，有研究報道，通過對患者血液中的外泌體進行分析，肺癌和胰腺癌的早期診斷率分別已經(jīng)能夠達到75%和90%。腫瘤細胞來源的外泌體特異性蛋白質或小分子RNA（miRNA）標志物可以作為腫瘤診斷檢測的高特異性指標，并且用于指示腫瘤的發(fā)展情況和侵襲程度。

2016年1月，全球首個基于外泌體的癌癥診斷產品在美國上市。由Exosome Diagnostics公司推出的這一液體活檢產品標志著新興的外泌體生物學向成熟邁進了一步。其他致力于外泌體診斷或治療應用的公司還包括Codiak BioSciences公司、Exosome Sciences公司、ExovitaBiosciences公司、CliniCanHealth Research公司、CARISLIFE SCIENCES公司和ExoCoBio公司等。雖然關于外泌體生物學的基本問題仍有很多懸而未決，但高通量診斷方面的應用開發(fā)已在不斷向前推進。

除了腫瘤，外泌體在其他疾病如心血管疾病等的診斷和治療的相關臨床試驗也在世界范圍內開展中。

2外泌體新型治療劑

腫瘤轉移是一個包括癌細胞侵入、血管中存活、宿主器官附著和殖民化等多步驟的復雜過程。外泌體能夠影響這個級聯(lián)反應的每一步，因此可作為腫瘤治療的靶點。腫瘤細胞在轉移到其他組織時需要在間質細胞間移動并到達血管中，在這個過程中，腫瘤細胞外泌體通過纖維連接蛋白促進腫瘤細胞的運動性，再通過蛋白酶促進細胞外基質的分解、血管生成，進而促進腫瘤轉移。

多數(shù)腫瘤細胞對轉移的組織具有指向性，而外泌體表面的整合素就是決定其指向性的因子，如外泌體αvβ5整合素決定了對肝臟的指向性，而外泌體α6β4?α6β1整合素決定了對肺部的指向性。

此外，惡性腫瘤細胞往往能夠通過分泌大量外泌體抑制宿主固有免疫。對外泌體的質譜研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤細胞的外泌體含有大量活化型的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），可以抑制宿主細胞α型干擾素(IFN-α)的產生。這就解釋了為什么部分腫瘤患者固有免疫低下，也為晚期癌癥患者的治療提供一個新的策略和理論依據(jù)。

3外泌體在心臟修復中同樣起著關鍵作用。

外泌體通過內含的miRNA直接調控基因表達，將信息傳遞給靶細胞。盡管干細胞移植治療是一種很有前景的修復損傷心臟組織并使其再生的輔助手段，但由于缺血心臟中移植細胞的存活狀況不佳，一般僅能觀察到心臟功能的輕度改善。最近的研究表明，干細胞釋放的外泌體可以作為心臟修復潛在的無細胞治療劑。

干細胞分泌的外泌體相比干細胞有如下優(yōu)點：（1）旁分泌效應，外泌體作為干細胞旁分泌作用的一種媒介；（2）組合起效，外泌體可與現(xiàn)有的組合物或方法進行組合；（3）個性化，外泌體可改造特定活性成分；（4）靶向特異性，外泌體被工程化改造后，具有靶向特定細胞類型或組織的功能；（5）安全性高，外泌體治療屬于無細胞療法。

事實上，動物實驗表明：在小鼠急性心肌梗塞術后，注射來源于間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）、心臟祖細胞（cardiacprogenitor cells，CPCs）、胚胎干細胞（Embryonic stem cell，ESC）或心肌源性細胞（Cardiosphere-derivedcells，CDCs）的外泌體均可改善心臟功能，減輕心臟纖維化，刺激血管生成。例如，心源性細胞外泌體（CDCexo）能通過特異性的巨噬細胞極化為急性心肌梗死提供心臟保護作用。

心臟再灌注后，CDCexo的輸注降低了大鼠和豬心肌梗死模型的梗死面積，而且CDCexo會減少梗死組織內CD68+巨噬細胞數(shù)量，并改變巨噬細胞的極化狀態(tài)。自體CD34+干細胞的移植可以改善缺血組織再灌注后的功能，并降低嚴重肢體缺血患者的截肢率。其作用機制在于：CD34+干細胞分泌的外泌體（CD34Exo）促進小鼠下肢缺血模型血管生成。

雖然臨床前研究的證據(jù)表明干細胞釋放的外泌體可以作為心肌修復的潛在無細胞治療劑，但是，目前將外泌體完全用作心臟修復治療劑之前還是有很多核心問題需要解決。

4外泌體作為藥物治療的遞送系統(tǒng)

外泌體本身的惰性相當高，但它們與細胞膜融合可將所攜帶的物質和信號傳遞到受體細胞并改變其生物學功能，因此，外泌體是納米藥物遞送或基因治療的潛在載體。外泌體作為功能性小RNA和蛋白質的天然載體也引起了藥物遞送領域的極大興趣，因為它可以利用這些囊泡治療性遞送各種核糖核酸分子、肽和合成藥物。

雖然系統(tǒng)遞送的外泌體主要在肝臟、腎臟和脾臟中積累，但通過在外泌體的外表面上展示特定的靶向分子。例如，識別靶抗原的肽或抗體片段，可以獲得靶向外泌體；通過在細胞分泌囊泡上展示糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定的納米抗體，可以使細胞分泌囊泡顯示多種蛋白，包括抗體、熒光蛋白和信號分子。自然分泌的外泌體分離純化直接作為藥物的潛力有限，但是，將自然的外泌體分泌所需組分摻入合成脂質體或納米顆粒中，并且使用可控程序組裝后的工程化外泌體模擬物在藥學上擁有更大的應用潛力。

外泌體作為疾病診斷標志物的潛在應用依賴于基于外泌體的藥物遞送系統(tǒng)的技術突破，要將其用于臨床治療，外泌體的大規(guī)模工業(yè)化生產還面臨很大的挑戰(zhàn)。首先，對外泌體的具體合成機制、功能了解并不是非常詳細。其次，現(xiàn)在缺乏經(jīng)濟有效的外泌體分離技術。然而，雖然當前外泌體生物學仍然不成熟，但越來越多的興趣和資金投入必將加速外泌體基礎研究進展和臨床轉化。